Sandra Jastrzembski
GENETISCHE DIVERSITÄT VON ECHINOCOCCUS MULTILOCULARIS: VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNGEN ZWEIER MARKERSYSTEME
Sandra Jastrzembski
D100
Dissertation der Universität Hohenheim, Institut für Parasitologie 2016.
Von der Fakultät Naturwissenschaften der Universität Hohenheim zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation.
| Dekan: | Prof. Dr. rer. nat. Heinz Breer |
| 1. berichtende Person: | Prof. Dr. rer. nat. Ute Mackenstedt |
| 2. berichtende Person: | Prof. Dr. rer. nat. Johannes Steidle |
| Eingereicht am: | 23.05.2016 |
| Mündliche Prüfung am: | 24.08.2016 |
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| ISBN Paperback: | 978-3-946589-12-9 |
| ISBN E-Book: | 978-3-946589-13-6 |
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Genetische Diversität von Echinococcus multilocularis:
vergleichende Untersuchungen zweier Markersysteme
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
Fakultät Naturwissenschaften Universität Hohenheim
Institut für Zoologie Fachgebiet Parasitologie
vorgelegt von Sandra Jastrzembski aus Essen 2016
| Dekan: | Prof. Dr. rer. nat. Heinz Breer |
| 1. berichtende Person: | Prof. Dr. rer. nat. Ute Mackenstedt |
| 2. berichtende Person: | Prof. Dr. rer. nat. Johannes Steidle |
| Eingereicht am: | 23.05.2016 |
| Mündliche Prüfung am: | 24.08.2016 |
A scientist in his laboratory is not only a technician: he is also a child placed before natural phenomena which impress him like a fairy tale.
(Marie Curie)
Eine Doktorarbeit zu schreiben ist schon schwer genug, aber noch schwerer ist es die richtigen Worte zu finden, um meinen Dank gegenüber den vielen Personen auszudrücken, die mich auf diesem langen Weg unterstützt haben.
Zunächst gilt mein Dank natürlich Frau Prof. Dr. Ute Mackenstedt, die mir das Thema zur Verfügung gestellt und es mir ermöglicht hat, in ihrer Arbeitsgruppe die Dissertation anzufertigen.
Herrn Prof. Dr. Johannes Steidle und Herrn Prof. Dr. Peter Rosenkranz vielen Dank für die Bereitschaft, als zweiter bzw. dritter Gutachter meiner Arbeit zu fungieren.
Herrn Dr. Thomas Romig, Frau Dr. Anke Dinkel und Frau Dr. Marion Wassermann möchte ich für die gute Betreuung danken. Vielen Dank, dass ihr drei mir immer alle Fragen egal ob zur Laborarbeit, dem Fuchsbandwurm und anderen Parasiten, oder sonstigen Dingen – geduldig beantwortet habt und mir bei Problemen jederzeit zur Verfügung standet.
Allen anderen Kollegen aus dem FG Parasitologie herzlichen Dank für die gute Zusammenarbeit und die angenehme Arbeitsatmosphäre.
Ein besonders herzlicher Dank gilt Frau Dr. Jenny Knapp, die mich in das komplexe Thema Mikrosatelliten eingearbeitet hat und mir über all die Jahre immer wieder bei ungezählten Fragen und Problemen geduldig zur Verfügung stand. Merci beaucoup Jenny!
Auch dem gesamten Team in Besançon gilt mein herzlicher Dank für die gute Zusammenarbeit, und dass sie mich während meiner Zeit dort so herzlich aufgenommen haben.
Den Mitarbeitern des Landesgesundheitsamtes Baden-Württemberg, insbesondere Herrn Dr. Rainer Oehme, vielen Dank dafür, dass ich dort das Sequenzieren lernen durfte.
Vielen Dank den Jägern und Jagdgemeinschaften der Schwäbischen Alb, die dem FG Parasitologie seit Jahren Füchse für Untersuchungen zur Verfügung stellen.
Conny, Steffi und Daniela aus der Tierökologie: Einfach nur Danke für die schöne Zeit!
Nicht zu vergessen Nicole und alle anderen „Biologen + 1“. Ich danke euch für die vielen Diskussionen, Aufmunterungen, Ratschläge, einfach für die Freundschaft, ein Wort, dass so viel mehr ausdrückt, als sich in Worte fassen lässt!
Meiner Familie, insbesondere meinen Eltern, möchte ich sagen, dass ich euch unendlich dankbar bin für die jahrelange Unterstützung und dass ihr immer an mich geglaubt habt. Danke!
Und zum Schluss und doch nicht zu Letzt: Danke meinem Mann Daniel, danke für alles!
| Abb. | Abbildung |
| Acc.-Nr. | Accession-Number |
| AE | alveoläre Echinokokkose |
| AS | Aminosäure |
| atp6 | Adenosintriphosphatase Untereinheit 6 |
| BLAST | Basic Local Alignment Search Tool |
| bp | Basenpaar |
| °C | Grad Celsius |
| CE | Zystische Echinokokkose |
| cm | Zentimeter |
| cob | Cytochrom b |
| cox1 | Cytochrom-C-Oxidase Untereinheit 1 |
| DNA | Desoxyribonukleinsäure (Desoxyribo Nucleic Acid) |
| dNTP | Desoxyribonukleosidtriphosphat |
| EtOH | Ethanol |
| EW | Endwirt |
| fw | forward Primer |
| g | Gramm |
| Ht | Haplotyp |
| IST | Intestinal Scraping Technique |
| kb | Kilobasen |
| km | Kilometer |
| MgCl2 | Magnesiumchlorid |
| Min. | Minute |
| mm | Millimeter |
| mM | Millimolar |
| ms | mikrosatelliten- |
| mt | mitochondrial |
| µm | Mikrometer |
| NaAc | Natriumacetat |
| NaOH | Natriumhydroxid |
| nd1 | NADH-Dehydrogenase Untereinheit 1 |
| nd2 | NADH-Dehydrogenase Untereinheit 2 |
| PBS | Phosphatgepufferte Salzlösung (Phosphate Buffered Saline) |
| PCR | Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction) |
| pmol | Pikomol |
| Ref. | Referenz |
| rev | reverse Primer |
| rpm | Umdrehungen pro Minute (Rotations Per Minute) |
| Sek. | Sekunde |
| spp. | species pluralis |
| SSCP | Single Strand Conformation Polymorphism |
| Tab. | Tabelle |
| TBE | Tris-Borat-EDTA-Puffer |
| UV | ultraviolett |
| ZW | Zwischenwirt |
Der 1863 erstmals von Leuckart beschriebene „kleine Fuchsbandwurm“ Echinococcus multilocularis ist einer der kleinsten Vertreter der Cestoda.
Taxonomisch gehört er innerhalb der Plathelminthes zur Klasse der Cestoda, Ordnung Cyclophyllidea. Die Familie Taeniidae wiederum besteht aus den Gattungen Taenia, Echinococcus, Hydatigera und Versteria (Nakao et al. 2013a).
Tab. 1: Taxonomische Einordnung von E. multilocularis
Stamm: Plathelminthes (Plattwürmer)
Klasse: Cestoda (Bandwürmer)
Ordnung: Cyclophyllidea
Familie: Taeniidae
Gattung: Echinococcus Rudolphi, 1801
Art: E. multilocularis Leuckart, 1863
Innerhalb der Gattung Echinococcus hat es in den letzten Jahren aufgrund neuer molekularbiologischer Daten größere Umstrukturierungen gegeben. Neben E. multilocularis, welcher im Menschen die sogenannte alveoläre Echinokokkose verursacht, gibt es die in Südamerika vorkommenden Arten E. vogeli und E. oligarthra, welche die polyzystische Echinokokkose verursachen. 2005 wurde in China eine weitere Art beschrieben, E. shiquicus, die neben dem weltweit verbreiteten Artkomplex von E. granulosus die zystische Echinokokkose verursacht (Xiao et al. 2005). Außerdem wurde 2008 von Hüttner et al. betätigt, dass E. felidis als eigenständige Art angesehen werden muss und somit nicht mehr als Strain von E. granulosus angesehen werden kann. Eine Aufzählung der nach aktuellen Erkenntnissen bestätigten Arten und Strains von Echinococcus granulosus sensu lato findet sich in Tabelle 2. Neben genetischen Unterschieden unterscheiden sich die einzelnen Arten auch morphologisch und anhand ihrer Zwischenwirte.
Tab. 2: Liste der bestätigten Arten von E. granulosus sensu lato (verändert nach Nakao et al. 2013b)
Die Größe der Adulti von Echinococcus multilocularis beträgt etwa 1-4mm und sie besitzen 4-5 Proglottiden. Am Scolex sitzen vier Saugnäpfe und ein zweireihiger Hakenkranz, womit sich der Fuchsbandwurm zwischen den Darmzotten festheftet. Die Nahrungsaufnahme findet über die Körperoberfläche statt, da Cestoda keinen Darm besitzen. In den Proglottiden der zwittrigen Würmer befinden sich sowohl die männlichen als auch die weiblichen Fortpflanzungsorgane. Die letzte gravide Proglottis ist, anders als bei E. granulosus, weniger als halb so lang wie der gesamte Wurm und enthält die befruchteten Eier und löst sich ab, um dann mit dem Kot des Wirts ausgeschieden zu werden (Eckert et al. 2001, Lucius & Loos- Frank 2008).
Abb.1: Adulter Echinococcus multilocularis (Foto: FG Parasitologie, Universität Hohenheim)
Nach der Befruchtung (üblich ist bei Echinococcus die Autogamie, also Selbstbefruchtung, während Heterogamie (Befruchtung zwischen verschiedenen Individuen) nur sehr selten auftritt) löst sich die gravide Proglottis ab und wird mitsamt den in ihr enthaltenen 200-300 embryonierten Eiern mit dem Kot des Wirts ausgeschieden. Die Eier des Parasiten haben einen Durchmesser von 30-40µm und enthalten das erste Larvenstadium, die Onkosphäre. Aufgrund ihrer keratinisierten Embryophore sind sie sehr resistent gegen Umwelteinflüsse und können unter günstigen Bedingungen (leichte Feuchtigkeit und Temperaturen zwischen 4 und 15°C) mehrere Monate überdauern. Hohe Temperaturen und Austrocknung überstehen sie dagegen nicht. Rein morphologisch lassen sich die Eier der Taeniiden nicht unterscheiden (Eckert et al. 2001, Lucius & Loos-Frank 2008).
Im Zwischenwirt werden die Onkosphären frei und gelangen über die Darmwand in den Blutstrom. Anschließend siedelt sich das zweite Larvenstadium, der so genannte Metacestode, insbesondere in der Leber an, wo eine ungeschlechtliche Vermehrung stattfindet. Es bilden sich dicht zusammenliegende, in Parasitengewebe eingebettete 2-15mm große Vesikeln, welche aus einer äußeren, azellulären Laminarschicht und einer inneren Keimschicht aufgebaut sind und das Wirtsgewebe infiltrieren. In ihnen liegen in einer gallertigen Substanz die Protoskolizes. In Gegensatz zu E. granulosus bilden sich keine flüssigkeitsgefüllten Blasen (Eckert et al. 2001).
Die Larvenmasse wächst durch exogene Knospung tumorartig immer weiter in gesundes Gewebe hinein. Diese Wachstumsform wird auch als alveolär bezeichnet, woher beim Menschen der Name der Erkrankung „alveoläre Echinokokkose“ stammt (Eckert et al. 2001).
Der sylvatische Lebenszyklus von E. multilocularis ist ein Räuber- Beute- Zyklus, in den Caniden als Endwirte und deren Beutetiere als Zwischenwirte involviert sind. Hunde und sehr selten Katzen kommen ebenfalls als Endwirte in Frage, wenn sie infizierte Nagetiere fressen. Der Mensch, der sich über die orale Aufnahme der Eier infizieren kann, ist aufgrund der evolutionären Sackgasse, die er für den Parasiten bildet, ein Fehlzwischenwirt.
Abb.2: Lebenszyklus von Echinococcus multilocularis (Abbildung: Dr. T. Romig, Universität Hohenheim)
Die Adulti leben im Darm der Endwirte, wo sie zwischen den Darmzotten angeheftet über ihr Tegument Nahrung aufnehmen. Im Endwirt findet auch die Fortpflanzung über Selbstbefruchtung (selten auch Kreuzbefruchtung) statt. Die die Eier enthaltende gravide Proglottis löst sich ab und wird mit dem Kot des Wirts ausgeschieden, wobei sie aufreißt und die Eier frei werden.
Diese werden von den Zwischenwirten mit der Nahrung, oder auch über kontaminiertes Trinkwasser, aufgenommen. Im Darm des Zwischenwirts schlüpft aus den Eiern die Onkosphäre, durchdringt die Darmwand und wird mit dem Blutstrom in die Leber gespült, wo sich der Metacestode, das zweite Larvenstadium bildet. Auch im Larvenstadium findet in den sich bildenden Brutkapseln eine, in diesem Fall asexuelle, Vermehrung durch Knospung statt und es entwickeln sich Protoskolizes (Eckert et al. 2001).
Im natürlichen Zwischenwirt findet dieses Wachstum in relativ kurzer Zeit statt, während es im Menschen über viele Jahre stattfindet und es entstehen oft nur wenige, oder auch gar keine Protoskolizes. Ein möglicher Grund ist die jeweilige Lebensspanne des Wirts, wobei der Mensch generell kein geeigneter Wirt zu sein scheint, da dieser oft keine graviden Metacestoden aufweist.
Frisst nun ein Endwirt einen infizierten Zwischenwirt, so entwickeln sich in dessen Darm aus den Protoskolizes wieder adulte Würmer und der Zyklus ist geschlossen.
Im Endwirt ist die Erkrankung asymptomatisch, während sie für (Fehl-) Zwischenwirte immer tödlich verläuft. Neben dem Menschen gibt es noch weitere Fehlwirte. Dazu zählen Haushund, Pferd, Schwein, Wildschwein, Nutria, sowie verschiedene Affenarten (Eckert & Deplazes 2004).
Der Zyklus findet nicht nur in ländlichen/ wenig besiedelten Regionen statt, sondern etabliert sich durch die zunehmende Einwanderung von Füchsen immer häufiger auch in Städten. Diese finden dort zusätzlich zu ihren (im Lebenszyklus von E. multilocularis als Zwischenwirt dienenden) Beutetieren eine große Anzahl weiterer Futterquellen, insbesondere Nahrungsabfälle des Menschen (Deplazes et al. 2004).
Je nach Land und Region kann ein mehr oder weniger breites Wirtsspektrum in den Zyklus involviert sein. Zusätzlich zu den im Folgenden beschriebenen Wirten können auch Neozoen als End- oder Zwischenwirte in Frage kommen.
Hauptendwirt von Echinococcus multilocularis in Europa ist der Rotfuchs (Vulpes vulpes), auf der norwegischen Insel Spitzbergen dient der Eisfuchs (Vulpes lagopus) als Endwirt. Bei Haushunden (Canis familiaris) und Katzen (Felis catus) wurde nachgewiesen, dass sich durch natürliche Infektion Eier- produzierende Stadien bilden können. Hunde sind jedoch deutlich stärker empfänglich für eine Infektion als Katzen. Eine Infektion bei Hunden und Katzen ist allerdings nur möglich, wenn sie die Gelegenheit haben, mit dem Fuchsbandwurm befallene Mäuse zu fressen. Auch der aus Asien eingewanderte Marderhund dient dem Parasiten als Endwirt. Als Zwischenwirte dienen dem Fuchsbandwurm in Europa hauptsächlich Feldmaus (Microtus arvalis) und Schermaus (Arvicola terrestris), aber auch Bisame (Ondatra zibethicus) können als Zwischenwirt fungieren. Selten wurde ein Befall bei Schneemaus (Microtus nivalis), Kurzohrmaus (Pitymys subterraneus), Rötelmaus (Myodes glareolus), Hausmaus (Mus musculus) und Feldhase (Lepus europaeus) nachgewiesen (Eckert et al. 2001; Vuitton et al. 2003; Jenkins et al. 2005; Romig et al. 2006, Chaignat et al. 2015).
Zu erwähnen sei hier, dass nach aktuellem Kenntnisstand Arvicola terrestris nicht mehr als einzelne Art angesehen wird, sondern sich in 2 Arten aufteilt, Arvicola scherman und Arvicola amphibius (Wilson & Reeder 2005). Da im überwiegenden Teil der Literatur jedoch weiterhin von A. terrestris gesprochen wird und insbesondere aus älteren Studien nicht eindeutig hervorgeht, welche Art gemeint ist, wird in der vorliegenden Arbeit allgemein von A. terrestris gesprochen.
In Asien dienen neben dem Rotfuchs (Vulpes vulpes) auch Eisfuchs (Vulpes lagopus), Steppenfuchs (Vulpes corsac), Wolf (Canis lupus), Haushund (Canis lupus familiaris), Schakal (Canis aureus), Marderhund (Nyctereutes procyonoides) und Tibetfuchs (Vulpes ferrilata) als Endwirte. Auch Wild- und Hauskatzen kommen hier als Endwirte in Frage. Zwischenwirte in Asien sind etwa 30 verschiedene Arten von Säugetieren u.a. der Gattungen Microtus, Arvicola, Meriones, Clethrionomys, Lagurus, und Lemmus. Weiter dienen auch der aus Amerika eingeschleppte Bisam, Erdhörnchen, Spitzmäuse, Murmeltiere und zwei Arten der Lagomorpha (Pika (Ochotona curzoniae) und Tibetanischer Wollhase (Lepus oiostolus)) als Zwischenwirte (Eckert et al. 2001; Vuitton et al. 2003).